> 本流程适用于任何蛋白质家族，对多物种 FASTA 序列执行 MSA → 共识序列 → 关键片段识别 → 氨基酸组成统计 → 功能预测的完整分析链路。
scripts/protein_key_fragment_analysis.py（完整分析流程）scripts/run_full_analysis.py（多物种批量 + 大样本采样）references/method.mdreferences/functional_domains.md（分析新蛋白家族时，在此补充对应 Pfam 保守域）# 单物种分析
python3 protein_key_fragment_analysis.py <物种名> <fasta路径>
# 多物种批量分析（推荐）
# 1. 将各物种 .fasta 文件放入 input_clean/ 目录
# 2. 运行批量脚本
python3 run_full_analysis.py
apt install clustalo 或 conda install clustalo）-）后得到连续共识序列共识序列生成原理：
MSA比对结果（多序列对齐）
位置: 1 2 3 4 5 ...
Seq1: M K H L P ...
Seq2: M K H L P ...
Seq3: M K H L A ...
↓ 统计频率
位置1: M(100%) → 写入 M
位置5: P(67%), A(33%) → 写入 P（若阈值≤67%）或 X（若阈值>67%）
关键参数：
functional_domains.md 中预先配置）> 分析新蛋白家族时，在 KNOWN_MOTIFS 和 CONSERVED_BLOCKS 中补充对应的 Pfam 特征序列（来源：Pfam / InterPro / UniProt）。
对每个关键片段统计各功能类别氨基酸的出现频率：
| 类别 | 氨基酸 |
|---|---|
| ------ | -------- |
| Hydrophobic（疏水性） | V, L, I, M |
| Nucleophilic（亲核性） | S, T, C |
| Aromatic（芳香性） | F, Y, W |
| Amide（酰胺类） | N, Q |
| Acidic（酸性） | D, E |
| Cationic（阳离子性） | H, K, R |
| 排除不统计 | X, A, G, P |
> ⚠️ 此分类体系与 aa-pair-analysis 完全一致，A/G/P 排除不统计。
composition 字段（含各类别计数、比例、主导类别、理化性质描述）根据各类别比例按优先级推断主要功能，结果写入 function_prediction 字段：
| 优先级 | 判断条件 | 功能预测 |
|---|---|---|
| -------- | --------- | --------- |
| 1 | Pfam 已知功能块命中 | 🔴 已知功能位点——高度保守催化/结合区域 |
| 2 | Cys 在片段中占比 ≥ 12% | 🟡 二硫键网络/结构骨架 |
| 3 | Nucleophilic ≥ 40% | 🟢 催化活性位点/磷酸化调控区（Ser/Thr/Cys核心） |
| 4 | Hydrophobic ≥ 45% | ⬛ 疏水折叠核心/跨膜区 |
| 5 | Aromatic ≥ 20% | 🟣 底物识别/π-π堆叠区 |
| 6 | Cationic ≥ 35% | ⚡ 正电荷底物结合区 |
| 7 | Acidic ≥ 35% | 🔵 金属离子螯合/催化酸基区 |
| 8 | Nucleophilic ≥ 25% + Cationic ≥ 15% | 🔵 亲核-阳离子协作底物识别区 |
| 9 | Hydrophobic ≥ 25% + Nucleophilic ≥ 25% | ⬛ 两亲性蛋白-蛋白相互作用界面 |
| 10 | Acidic ≥ 20% + Cationic ≥ 20% | ⚡ 电荷互补区（盐桥网络/静电引导） |
| 11 | Amide ≥ 20% | 🔵 酰胺富集区（氢键网络/糖基化位点） |
| 12 | 以上均不满足 | 🔵 混合型功能区（Linker/多功能结合界面） |
_分析报告.md + _key_fragments.json（含 composition 和 function_prediction 字段）汇总分析报告_含功能预测.mdanalysis_results/
├── 分类名_按物种整合/
│ ├── 物种名/
│ │ ├── 氨基酸对分析/
│ │ │ ├── formulation.json # 配方数据
│ │ │ ├── formulation.txt # 人类可读配方
│ │ │ └── top5_details.json # Top5对型详情
│ │ ├── 关键片段预测/
│ │ │ ├── *_consensus.fasta # 共识序列
│ │ │ ├── *_key_fragments.json # 关键片段数据
│ │ │ └── *_分析报告.md # 片段分析报告
│ │ └── 物种综合分析报告.md # 完整综合分析报告
│ └── 物种B/
│ └── ...
├── _所有物种配方总览.md # 所有物种配方汇总
└── _所有物种配方总览.csv # CSV格式汇总
优势：
results/
├── Species_A/
│ ├── Species_A_aligned.fasta
│ ├── Species_A_consensus.fasta
│ ├── Species_A_key_fragments.json
│ └── Species_A_分析报告.md
└── ...
编辑 scripts/protein_key_fragment_analysis.py：
KNOWN_MOTIFS = {
# 你的蛋白家族特征序列
"你的功能域名称": {
"pattern": ["序列模式"],
"context_note": "描述",
"function": "功能说明",
"criticality": "重要性级别"
}
}
关键片段识别阈值（推荐）：
# 严格模式（推荐用于核心功能位点识别）
# 连续区域保守率 ≥ 90%，长度 ≥ 6aa
# 结果更精细，片段更短但保守性更高
# 宽松模式（默认）
# 连续区域保守率 ≥ 50%，长度 ≥ 6aa
# 结果片段更长，但可能包含保守性较低的区域
> 实践建议：
> - 研究核心功能位点 → 使用 90%阈值
> - 初步筛选保守区域 → 使用 50%阈值
> - 不同阈值会导致完全不同的生物学解释，需根据研究目的选择
命令行调整：
python3 protein_key_fragment_analysis.py <物种> <fasta> --threshold 0.9
# Ubuntu/Debian
sudo apt install clustalo
# 或 conda
conda install -c bioconda clustalo
⚠️ 重要：多分类分析时必须验证数据独立性
当对同一批数据的不同分类（如阳离子-pi、贻贝粘附蛋白）进行分析时：
shared_alignments_分类名）常见问题：
不同分类错误地共享了相同的氨基酸对分析CSV数据，导致结果不可靠。
验证方法：
# 检查MSA缓存独立性
ls shared_alignments_分类A/
ls shared_alignments_分类B/
# 应无相同文件名（同物种名除外）
# 检查配方独立性
# 对比不同分类的 species_formulations.csv
# 同物种的配方应不同（若数据来源不同）
| 维度 | aa-pair-analysis | protein-key-fragment-analysis（本工具） |
|---|---|---|
| ------ | ------------------ | -------------------------------------- |
| 关注点 | 氨基酸类别组合统计规律 | 具体序列片段的结构/功能 |
| 输出 | φ值、Top5对型排名 | 片段序列、位置、功能注释 |
| 配合 | 可作为本工具的前置输入 | 需先进行 MSA 获取共识序列 |
联合分析推荐流程：
# 1. 先用 aa-pair-analysis 进行统计筛选
# 2. 再用本工具进行详细功能片段分析
python3 run_combined_analysis.py <任务名> <FASTA目录>
# 3. 生成物种综合分析报告（包含完整共识序列）
python3 integrate_species_results.py
每个物种生成 物种综合分析报告.md，包含：
# 批量生成所有物种的综合分析报告
python3 generate_species_reports.py \
--input-base analysis_results/ \
--output-dir 整合分析结果/
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